D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
ఫైటోపాథోజెనిక్ ఫంగస్ కొల్లెటోట్రిచమ్ కోకోడ్స్ బంగాళదుంపలు మరియు టొమాటోలలో ప్రమాదకరమైన వ్యాధులను కలిగిస్తాయి, వీటిని ఆంత్రాక్నోస్ మరియు దుంపల నల్ల మచ్చ అని పిలుస్తారు. పదనిర్మాణ లక్షణాల ద్వారా, ఇతర సూక్ష్మజీవుల వల్ల కలిగే వ్యాధుల నుండి వేరు చేయడం చాలా కష్టం; ఆకుపచ్చ టమోటా పండ్లపై, వ్యాధి లక్షణరహితంగా ఉంటుంది, పండిన ఎరుపు పండ్లపై మాత్రమే కనిపిస్తుంది. వ్యాధికారక త్వరిత మరియు ఖచ్చితమైన నిర్ధారణ కోసం, నిజ-సమయ PCR పరీక్ష వ్యవస్థ అందించబడుతుంది. ఒక పరీక్షా వ్యవస్థను అభివృద్ధి చేయడానికి, రష్యాలోని వివిధ ప్రాంతాలలో బంగాళాదుంప దుంపల నుండి వేరుచేయబడిన 45 C. కోకోడ్ జాతుల గ్లిసరాల్ ట్రైఫాస్ఫేట్ డీహైడ్రోజినేస్ జన్యువు యొక్క న్యూక్లియోటైడ్ క్రమం నిర్ణయించబడింది.
పొందిన ఫలితాలు మరియు GenBank డేటాబేస్లో అందుబాటులో ఉన్న ఇతర జాతుల సారూప్య శ్రేణుల విశ్లేషణ ఆధారంగా, జాతుల-నిర్దిష్ట ప్రైమర్లు మరియు C. కోకోడ్ల కోసం ప్రోబ్ రూపొందించబడ్డాయి. సృష్టించబడిన పరీక్షా విధానం యొక్క విశిష్టతను తనిఖీ చేయడానికి, టమోటా మరియు బంగాళాదుంప మొక్కలతో సంబంధం ఉన్న 15 విభిన్న జాతుల పరాన్నజీవి మరియు సాప్రోట్రోఫిక్ శిలీంధ్రాల యొక్క స్వచ్ఛమైన సంస్కృతుల నుండి వేరుచేయబడిన DNAతో PCR నిర్వహించబడింది (ఫ్యూసేరియం ఆక్సిస్పోరమ్, F. వెర్టిసిలియం, ఫోమోప్సిస్ ఫేసోలి, ఆల్టర్నేరియా ఆల్టర్నేటా, హెల్మింతోస్పోరియం. , Colletotricum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, స్టెంఫిలియం వెసికారియం, హెల్మింతోస్పోరియం సోలాని, Phomopsis ఫేసోలీ, నియోనెక్ట్రియా రాడికోలా, Rhizoctonia solani, పెన్సిలియం sp., Cladosporium fulvum, C. క్లాడోస్). Colletotricum coccodes DNA ఉనికిని 20-27 థ్రెషోల్డ్ సైకిల్ వద్ద నిర్ణయించారు, అయితే ఇతర జాతులు 40 చక్రాల తర్వాత కనుగొనబడ్డాయి లేదా కనుగొనబడలేదు. విశ్లేషించబడిన PCR మిశ్రమంలో 0.01 ng / mm3 కంటే ఎక్కువగా ఉన్న C. కోకోడ్ DNA సాంద్రతలను విశ్వసనీయంగా గుర్తించడాన్ని పరీక్షా విధానం సాధ్యం చేస్తుంది. ఫంగల్ వ్యాధుల లక్షణాలతో టమోటా ఆకులలో మరియు వ్యాధి యొక్క బాహ్య లక్షణాలు లేకుండా బంగాళాదుంప దుంపలలో సి. ఫంగల్ ఇన్ఫెక్షన్ లక్షణాలతో కూడిన ఆకులు క్రాస్నోడార్ భూభాగంలోని రెండు వేర్వేరు క్షేత్రాల నుండి సేకరించబడ్డాయి, దుంపలు - కోస్ట్రోమా, మాస్కో, కలుగా, నిజ్నీ నొవ్గోరోడ్ ప్రాంతాలలోని పొలాల నుండి. C. కోకోడ్స్ DNA కలిగిన ఒక టమోటా ఆకు క్రాస్నోడార్ భూభాగంలో కనుగొనబడింది; కోస్ట్రోమా, మాస్కో, కలుగా ప్రాంతాలలో పెరిగిన దుంపల 5 నమూనాలలో ఈ వ్యాధికారక DNA యొక్క గణనీయమైన ఉనికిని కనుగొనబడింది.
పరిచయం
కొల్లెటోట్రిచమ్ జాతికి చెందిన పుట్టగొడుగులు తృణధాన్యాలు, కూరగాయలు, మూలికలు, శాశ్వత పండ్లు మరియు బెర్రీ మొక్కలను ప్రభావితం చేసే ప్రమాదకరమైన ఫైటోపాథోజెన్లు. ఈ జాతికి చెందిన సర్వవ్యాప్త జాతులలో ఒకటి, కొల్లెటోట్రిచమ్ కోకోడ్స్ (వాల్ర్).
హ్యూస్, ఆంత్రాక్నోస్ మరియు బంగాళాదుంపలు మరియు టొమాటోల యొక్క బ్లాక్ స్పాట్ యొక్క కారకం, మరియు సోలనేసి కుటుంబానికి చెందిన అనేక ఇతర మొక్కల వ్యాధులకు కారణమవుతుంది. కలుపు మొక్కలు (డిల్లార్డ్, 1992). C. కోకోడ్లు మొక్క యొక్క అన్ని భూగర్భ భాగాలు, కాండం మూలాలు, ఆకులు మరియు పండ్లను ప్రభావితం చేస్తాయి (ఆండ్రివాన్ మరియు ఇతరులు, 1998; జాన్సన్, 1994). సోకిన బంగాళాదుంప దుంపల పై తొక్కపై, అస్పష్టంగా ఉచ్ఛరించే అంచులతో బూడిద రంగు మచ్చల అభివృద్ధిని గమనించవచ్చు, దానిపై స్పోర్యులేషన్ మరియు మైక్రోస్క్లెరోటియా యొక్క నల్ల చుక్కలు స్పష్టంగా కనిపిస్తాయి. నిల్వ సమయంలో, దుంపల గుజ్జులో మెత్తబడిన విషయాలతో పూతల ఏర్పడవచ్చు, అనగా. వ్యాధి ఆంత్రాక్నోస్ దశలోకి ప్రవేశిస్తుంది, అయితే ఇది చాలా అరుదు.
అదే సమయంలో, ఆంత్రాక్నోస్ (చిన్న నల్ల చుక్కలతో చర్మపు పూతల) యొక్క లక్షణాలు టమోటా పండ్లలో విలక్షణమైనవి. ఆకులపై, C. కోకోడ్ల లక్షణాలు ముదురు గోధుమ రంగు మచ్చలుగా కనిపిస్తాయి, సాధారణంగా పసుపు కణజాలం (జాన్సన్, 1994).
దుంపలపై నల్ల మచ్చల అభివృద్ధి వారి రూపాన్ని పాడు చేస్తుంది, ఇది కడిగిన ఎర్ర-పై తొక్క బంగాళాదుంపలను విక్రయించేటప్పుడు ప్రత్యేకంగా ఉచ్ఛరిస్తారు. పీల్ డీలామినేషన్ అదనపు బాష్పీభవనానికి దారితీస్తుంది మరియు నిల్వ నష్టాలను పెంచుతుంది (ఆకలి మరియు మెక్ఇంటైర్, 1979). ఇతర మొక్కల అవయవాలకు నష్టం జరగడం వల్ల దిగుబడి తగ్గుతుంది, ఇది ఓపెన్ మరియు క్లోజ్డ్ గ్రౌండ్లో గుర్తించబడింది (జాన్సన్, 1994; త్రోర్ మరియు ఇతరులు., 1999). C. కోకోడ్ల వల్ల వచ్చే వ్యాధులు రష్యాతో సహా ప్రపంచంలోని దాదాపు అన్ని బంగాళాదుంపలను ఉత్పత్తి చేసే ప్రాంతాలలో సర్వసాధారణం (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). C. కోకోడ్లకు వ్యతిరేకంగా ఉన్న శిలీంద్రనాశకాల యొక్క తగినంత ప్రభావం మరియు నిరోధక రకాలు లేకపోవడం వల్ల ఈ వ్యాధుల నియంత్రణ కష్టం (చదవండి, దాచండి, 1995).
C. కోకోడ్ల యొక్క ఇనోక్యులమ్ విత్తన దుంపలలో (చదవండి, దాచండి, 1988; జాన్సన్ మరియు ఇతరులు, 1997), టమోటా విత్తనాలు (బెన్-డేనియల్ మరియు ఇతరులు, 2010), మట్టిలో, మొక్కల శిధిలాల మీద ఎక్కువ కాలం జీవించగలవు. (డిల్లార్డ్, 1990 ; డిల్లార్డ్, కాబ్, 1993) మరియు కలుపు మొక్కలలో (రైడ్, పెన్నీప్యాకర్, 1987). అనేకమంది రచయితల రచనలు (చదవండి, దాచండి, 1988; బార్క్డాల్, డేవిస్, 1992; జాన్సన్ మరియు ఇతరులు., 1997; డిల్లార్డ్, కాబ్, 1993) బంగాళాదుంపలు మరియు టమోటాలలో వ్యాధి యొక్క అభివృద్ధి ఎక్కువగా ఉనికిపై ఆధారపడి ఉంటుంది. విత్తనం మరియు మట్టిలో ఐనోక్యులమ్. అందువల్ల, వ్యాధి నుండి నష్టాలను తగ్గించడానికి, విత్తన పదార్థంలో, మట్టిలో, సీడ్ బంగాళాదుంప దుంపలు మరియు టమోటా విత్తనాలలో నిల్వ చేయడానికి వేసిన ఫంగస్ యొక్క ప్రచారం (పరిమాణంతో సహా) నిర్ధారించడం అవసరం. మట్టి మరియు మొక్కల పదార్థాలలో పదనిర్మాణ రోగనిర్ధారణ మైక్రోస్క్లెరోటియా ఉనికి ద్వారా మాత్రమే నిర్వహించబడుతుంది, అయితే, ఇతర రకాల శిలీంధ్రాలలో కూడా ఇవి కనిపిస్తాయి.
దుంపలపై లక్షణాలు హెల్మింతోస్పోరియం సోలాని అనే శిలీంధ్రం వల్ల కలిగే వెండి స్కాబ్ను పోలి ఉంటాయి. కొల్లెటోట్రిచమ్ కోకోడ్లు మరియు హెల్మింతోస్పోరియం సోలానీలను స్వచ్ఛమైన సంస్కృతిలో వేరుచేయడం చాలా కష్టం మరియు పోషక మాధ్యమంలో నెమ్మదిగా పెరుగుదల కారణంగా చాలా సమయం పడుతుంది. కొల్లెటోట్రిచమ్ కోకోడ్లను త్వరగా గుర్తించడానికి, వాయిద్య విశ్లేషణ పద్ధతులను ఉపయోగించడం అవసరం. అత్యంత అనుకూలమైన పద్ధతి పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్ (PCR) మరియు దాని సవరణ - నిజ-సమయ PCR. ప్రస్తుతం, rDNA యొక్క ITS2002 ప్రాంతం కోసం బ్రిటిష్ పరిశోధకులు (కల్లెన్ మరియు ఇతరులు, 1) అభివృద్ధి చేసిన పరీక్షా విధానం యూరప్ మరియు యునైటెడ్ స్టేట్స్లో ఉపయోగించబడుతోంది. దీని ఉపయోగం రష్యన్ ఐసోలేట్ల విశ్లేషణలో మంచి ఫలితాలను చూపించింది (బెలోవ్ మరియు ఇతరులు, 2018). అయినప్పటికీ, C. కోకోడ్లు చాలా వేరియబుల్ మరియు ఒకే DNA క్రమం నుండి గుర్తించడం తప్పుడు ప్రతికూల ఫలితాలకు దారి తీస్తుంది. మరింత విశ్వసనీయమైన రోగనిర్ధారణ కోసం, అనేక జాతుల-నిర్దిష్ట DNA సీక్వెన్స్లను విశ్లేషించడం అవసరం, దీనికి సంబంధించి మేము గ్లైసెరాల్డిహైడ్-3-ఫాస్ఫేట్ డీహైడ్రోజినేస్ జన్యువు యొక్క క్రమం ద్వారా C. కోకోడ్లను గుర్తించడానికి అనుమతించే అసలైన పరీక్షా విధానాన్ని అభివృద్ధి చేసాము.
సామాగ్రి మరియు పద్ధతులు
సృష్టించిన పరీక్షా వ్యవస్థల ప్రభావం మరియు విశిష్టతను అంచనా వేయడానికి, మేము 15 రకాల శిలీంధ్రాల యొక్క స్వచ్ఛమైన సంస్కృతులను ఉపయోగించాము, టమోటా ఆకులు మరియు పండ్లు, బంగాళాదుంప దుంపలు (టేబుల్ 1) యొక్క ప్రభావిత నమూనాల నుండి రచయితలచే వేరుచేయబడింది. ఐసోలేషన్ కోసం, మేము ఫంగల్ ఇన్ఫెక్షన్ లక్షణాలతో మొక్కల అవయవాలను తీసుకున్నాము, బుష్కు ఒకటి కంటే ఎక్కువ అవయవాలు లేవు.
పై తొక్కతో ఒక గడ్డ దినుసు ముక్క, టమోటా పండు ముక్క మరియు ప్రభావితమైన ఆకును బైనాక్యులర్ మైక్రోస్కోప్ క్రింద ఉంచారు, ఆ తర్వాత మైసిలియం, బీజాంశం లేదా కణజాలం యొక్క భాగాన్ని అగర్ మాధ్యమం (వోర్ట్ అగర్) లోకి బదిలీ చేస్తారు. పదునైన పదునైన విచ్ఛేద సూదితో పెట్రీ డిష్. ఐసోలేట్లు 4 ° C వద్ద టెస్ట్ ట్యూబ్లలో అగర్ స్లాంట్లో నిల్వ చేయబడ్డాయి.
శిలీంధ్ర వ్యాధుల లక్షణాలతో కూడిన టమోటా ఆకుల నమూనాలు, విశ్లేషణ కోసం ఉద్దేశించబడ్డాయి, సేకరించిన వెంటనే (పొలంలో) 70% ఇథైల్ ఆల్కహాల్లో ఉంచబడ్డాయి, దీనిలో అవి DNA ఐసోలేషన్ వరకు నిల్వ చేయబడతాయి. బంగాళాదుంప దుంపలు ప్రయోగశాలకు పంపిణీ చేయబడ్డాయి, వాటి నుండి ఒలిచిన (2 × 1 సెం.మీ ముక్క) మరియు –20 ° C వద్ద స్తంభింపజేయబడ్డాయి. DNA ఐసోలేషన్ వరకు స్తంభింపజేయబడుతుంది.
DNA ఐసోలేషన్ కోసం శిలీంధ్రాల యొక్క స్వచ్ఛమైన సంస్కృతులు ద్రవ బఠానీ మాధ్యమంలో పెరిగాయి. ఫంగస్ యొక్క మైసిలియం ద్రవ మాధ్యమం నుండి తొలగించబడింది, ఫిల్టర్ పేపర్పై ఎండబెట్టి, ద్రవ నైట్రోజన్లో స్తంభింపజేయబడింది, సజాతీయీకరించబడింది, CTAB బఫర్లో పొదిగేది, క్లోరోఫామ్తో శుద్ధి చేయబడింది, ఐసోప్రోపనాల్ మరియు 0.5 M పొటాషియం అసిటేట్ మిశ్రమంతో అవక్షేపించబడింది, 2%తో రెండుసార్లు కడుగుతారు. మద్యం. ఫలితంగా DNA డీయోనైజ్డ్ నీటిలో కరిగించబడుతుంది మరియు –70 ° C వద్ద నిల్వ చేయబడుతుంది (కుతుజోవా మరియు ఇతరులు, 20). Qubit 2017 (కియాగెన్, జర్మనీ)లో డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA కోసం HS DNA క్వాంటిఫికేషన్ కిట్ని ఉపయోగించి DNA ఏకాగ్రతను కొలుస్తారు. ఆల్కహాల్ చేయబడిన మరియు ఘనీభవించిన నమూనాలు ద్రవ నైట్రోజన్లో ట్రిట్యురేట్ చేయబడ్డాయి, ఆపై పైన వివరించిన విధంగా DNA వెలికితీత జరిగింది (స్వచ్ఛమైన శిలీంధ్ర సంస్కృతుల మైసిలియం కోసం).
టేబుల్ 1. పనిలో ఉపయోగించే శిలీంధ్రాల జాతుల మూలం
పుట్టగొడుగు పేరు | మొక్క, అవయవం | ఎంపిక స్థలం |
---|---|---|
కొల్లెటోట్రిచమ్ కోకోడ్స్ 1, సి. కోకోడ్స్ 2, సి. కోకోడ్స్ 3, ఇలియోనెక్ట్రియా క్రాస్సా, రైజోక్టోనియా సోలాని | బంగాళదుంప దుంప | కోస్ట్రోమా ప్రాంతం, 1వ ఫీల్డ్ జనరేషన్ యొక్క బంగాళాదుంప దుంపలు, రెడ్ స్కార్లెట్ సాగు |
కొల్లెటోట్రిచమ్ కోకోడ్లు 4 | బంగాళదుంప ఆకు | ప్రతినిధి మారి ఎల్, యోష్కర్-ఓలా |
హెల్మింతోస్పోరియం సోలని | బంగాళదుంప దుంప | మగడాన్ ప్రాంతం, పోస్. డేరా, బంగాళదుంప దుంప |
క్లాడోస్పోరియం ఫుల్వమ్ | టమోటా ఆకు | మాస్కో ప్రాంతం, పెద్ద పండ్ల టమోటా |
ఆల్టర్నేరియా టొమాటోఫిలా | టమోటా పండు | ఆల్-రష్యన్ రీసెర్చ్ ఇన్స్టిట్యూట్ ఆఫ్ ప్లాంట్ ప్రొటెక్షన్ యొక్క మైకాలజీ మరియు ఫైటోపాథాలజీ యొక్క ప్రయోగశాల సిబ్బందిచే అప్పగించబడింది |
ఫ్యూసేరియం వెర్టిసిలియం, ఫోమోప్సిస్ఫాసియోలీ, ఆల్టర్నేరియా ఆల్టర్నేటా, ఫెల్లినస్ ఫెర్రుగినియోవెలుటినస్, స్టెంఫిలియం వెసికారియం, క్లాడోస్పోరియం క్లాడోస్పోరియోడ్స్, అక్రోడోంటియమ్ లుజులే, పెన్సిలియం sp. | టమోటా పండు | క్రాస్నోడార్ టెరిటరీ, క్రిమియన్ జిల్లా, గ్రేడ్ క్రీమ్ |
ఫ్యూసేరియం ఆక్సిస్పోరం | గోధుమ రూట్ | మాస్కో ప్రాంతం |
PCR DTprime యాంప్లిఫైయర్ (DNA-టెక్నాలజీ)పై నిర్వహించబడింది. PCR కోసం, ఒరిజినల్ ప్రైమర్లు మరియు గ్లిసరాల్ ట్రిఫాస్ఫేట్ డీహైడ్రోజినేస్ జన్యువు యొక్క జాతుల-నిర్దిష్ట ప్రాంతం కోసం ఒక ప్రోబ్ ఉపయోగించబడ్డాయి: ఫార్వర్డ్ ప్రైమర్ Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, రివర్స్ ప్రైమర్ Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGGT1 - FGGTTCTAGbe probe). ప్రైమర్లు 213 bp ప్రాంతాన్ని విస్తరించాయి.
ప్రతిచర్య మొత్తం DNAలో 50 ng (ఆకులు మరియు దుంపలను విశ్లేషించేటప్పుడు) మరియు 10 ng (శిలీంధ్రాల స్వచ్ఛమైన సంస్కృతుల నుండి DNA ను విశ్లేషించేటప్పుడు) తీసుకుంది. ప్రతిచర్య మిశ్రమం (35 μl) పారాఫిన్ పొర ద్వారా రెండు భాగాలుగా విభజించబడింది: దిగువ (20 μl)లో 2 μl 10 × రియాక్షన్ బఫర్ (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% మధ్య-20), ప్రతి డియోక్సిన్యూక్లియోటైడ్ ట్రైఫాస్ఫేట్లో 0.5 mM, ప్రతి ప్రైమర్లో 7 pmol మరియు హైడ్రోలైజబుల్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్ యొక్క 4 pmol; పైభాగంలో 1 μl 10 × PCR బఫర్ మరియు 1 U టాక్ పాలిమరేస్ ఉన్నాయి.
పారాఫిన్తో మిశ్రమాన్ని వేరు చేయడం వలన గొట్టాలను 5 ° C ఉష్ణోగ్రత వద్ద చాలా కాలం పాటు నిల్వ చేయడానికి మరియు 10 ° C కంటే ఎక్కువ ఉష్ణోగ్రత వద్ద 80 నిమిషాలు వేడి చేసిన తర్వాత PCR కోసం వేడి ప్రారంభాన్ని అందించడానికి అనుమతిస్తుంది. PCR కింది ప్రోగ్రామ్ ప్రకారం నిర్వహించబడింది: 94.0 ° C - 90 s (1 చక్రం); 94.0 ° C - 30 సె; 64.0 ° C - 15 సె (5 చక్రాలు); 94.0 ° C - 10 సె; 64.0 ° C - 15 సె (45 సైకిల్స్); 10.0 ° C - నిల్వ.
ఫలితాలు మరియు చర్చ
గ్లిసరాల్ ట్రైఫాస్ఫేట్ డీహైడ్రోజినేస్ జన్యువు యొక్క సీక్వెన్సులు రష్యాలోని వివిధ ప్రాంతాలలో ఆకులు, కాండం, బంగాళాదుంప దుంపలు మరియు టమోటా పండ్ల (కుటుజోవా, 45) నుండి వేరుచేయబడిన 2018 జాతులలో నిర్ణయించబడ్డాయి. అన్ని జాతుల పరిశోధించిన క్రమాలు రెండు న్యూక్లియోటైడ్లలో విభిన్నంగా 2 సమూహాలుగా విభజించబడ్డాయి. KY496634 మరియు KY496635 సంఖ్యల క్రింద రెండు సమూహాల ప్రతినిధుల న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్సులు GenBankలో జమ చేయబడ్డాయి.
ప్రైమర్లు coc70gdf, coc280gdr మరియు వాటి ఆధారంగా రూపొందించబడిన cocgdz ప్రోబ్లు BLAST ప్రోగ్రామ్ని ఉపయోగించి తనిఖీ చేయబడ్డాయి (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) GenBank డేటాబేస్లో అందుబాటులో ఉన్న కొల్లెటోట్రిచమ్ మరియు ఇతర జీవుల జాతికి చెందిన గ్లిసరాల్ ట్రైఫాస్ఫేట్ డీహైడ్రోజినేస్ జన్యువు యొక్క అన్ని శ్రేణులపై.
ప్రైమర్లు మరియు ప్రోబ్లకు అత్యంత సమానమైన ఇతర జీవుల DNA ప్రాంతాలు ఏవీ కనుగొనబడలేదు.
C. కోకోడ్స్ DNA, ఆంత్రాక్నోస్ సోకిన బంగాళాదుంప ఆకు నుండి DNA (2017లో మారి ఎల్లో సేకరించబడింది, రెడ్ స్కార్లెట్ రకం) మరియు బ్లాక్ స్పాట్తో ప్రభావితమైన దుంపల పై తొక్క (సేకరించినవి)తో కూడిన నమూనాలను ఉపయోగించి పరీక్షా వ్యవస్థ యొక్క సున్నితత్వం తనిఖీ చేయబడింది. కోస్ట్రోమా ప్రాంతంలో, వివిధ రెడ్ స్కార్లెట్, టేబుల్ 2). దుంపలు మరియు బంగాళాదుంప ఆకులలో DNA ఉనికిని నిర్ధారించడానికి, C. కోకోడ్ జాతులు వాటి నుండి స్వచ్ఛమైన సంస్కృతులుగా వేరు చేయబడ్డాయి.
పరీక్షా వ్యవస్థ యొక్క సున్నితత్వ విశ్లేషణ యొక్క ఫలితాలు PCR మిశ్రమంలో దాని మొత్తం కంటెంట్ 0.05 ng కంటే ఎక్కువగా ఉన్నప్పుడు ఒక నమూనాలో C. కోకోడ్ DNA ఉనికిని విజయవంతంగా నిర్ధారించడానికి ఉపయోగించవచ్చని చూపిస్తుంది. ఒక స్క్లెరోటియాలో సగటున 0.131 ng, మరియు ఒక బీజాంశం 0.04 ng DNA (కల్లెన్ మరియు ఇతరులు, 2002) కలిగి ఉన్నందున, గుర్తించడానికి ఇది చాలా సరిపోతుంది. ఇంగ్లీష్ గ్రూప్ (కల్లెన్ మరియు ఇతరులు, 2002) అభివృద్ధి చేసిన పరీక్షా విధానం ఇదే విధమైన సున్నితత్వాన్ని చూపించింది (34 ng DNA వద్ద థ్రెషోల్డ్ సైకిల్ 0.05 మరియు 37 ng వద్ద 0.005).
అన్ని సందర్భాలలో C. కోకోడ్లను కలిగి ఉన్న సహజ నమూనాల విశ్లేషణ నమూనాలో దాని ఉనికిని విశ్వసనీయంగా బహిర్గతం చేయడం సాధ్యపడింది (టేబుల్ 2). DNA ఐసోలేషన్ కోసం ప్రతిపాదిత పద్ధతి సహజ మొక్కల నమూనాల విశ్లేషణకు కూడా వర్తిస్తుంది.
టేబుల్ 2. నిజ-సమయ PCR కోసం కొల్లెటోట్రిచమ్ కోకోడ్ల గుర్తింపు కోసం ప్రతిపాదిత పరీక్ష వ్యవస్థ యొక్క సున్నితత్వాన్ని నిర్ణయించడం
Образец | నమూనాలో DNA మొత్తం *, ng | థ్రెషోల్డ్ సైకిల్ | C. కోకోడ్ల గుర్తింపు |
---|---|---|---|
మైసిలియం కొల్లెటోట్రిచమ్ కోకోడ్లు | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
గడ్డ దినుసు తొక్క 1 | 50 | 32 | + |
గడ్డ దినుసు తొక్క 2 | 50 | 30 | + |
గడ్డ దినుసు తొక్క 3 | 50 | 31.5 | + |
బంగాళదుంప ఆకు | 50 | 29.5 | + |
గమనిక. * PCR ఉత్పత్తుల మిశ్రమంలో.
15 రకాల శిలీంధ్రాల నుండి సేకరించిన DNA నమూనాలపై పరీక్షా వ్యవస్థ యొక్క విశిష్టతను పరీక్షించడం జరిగింది. శిలీంధ్రాల యొక్క అన్ని జాతులు రచయితలచే ప్రభావితమైన మరియు ఆరోగ్యకరమైన పండ్లు మరియు టొమాటో, బంగాళాదుంప దుంపల నుండి వేరుచేయబడ్డాయి; గోధుమ మూలం నుండి ఒక జాతి వేరుచేయబడింది (టేబుల్ 1). పండు యొక్క ఉపరితలం నుండి వేరుచేయబడిన వాటిలో, టమోటాలకు వ్యాధికారకమైన జాతులు కూడా ఉన్నాయి (ఉదాహరణకు, ఫెల్లినస్ ఫెర్రుగినియోవెలుటినస్).
C. cocodes DNA 20-27 థ్రెషోల్డ్ సైకిల్లో కనుగొనబడిందని అధ్యయనాలు చూపించాయి, అయితే ఇతర శిలీంధ్ర జాతులు కనుగొనబడలేదు లేదా సైకిల్ 40 తర్వాత సిగ్నల్ ఇవ్వబడలేదు, ఇది నిర్దిష్ట శబ్దం ప్రభావానికి కారణమని చెప్పవచ్చు (టేబుల్ 3).
టేబుల్ 3. వివిధ రకాల పుట్టగొడుగుల కోసం పరీక్ష వ్యవస్థను తనిఖీ చేస్తోంది
పుట్టగొడుగు పేరు | థ్రెషోల్డ్ సైకిల్ |
కొల్లెటోట్రిచమ్ కోకోడ్లు 1 | 20.9 |
C. కోకోడ్లు 2 | 22.6 |
C. కోకోడ్లు 3 | 23 |
C. కోకోడ్లు 4 | 22 |
ఫ్యూసేరియం ఆక్సిస్పోరం | > 40 |
F. వెర్టిసిలియం | > 40 |
రైజోక్టోనియా సోలని | > 40 |
ఫోమోప్సిస్ ఫేసోలీ | > 40 |
ఆల్టర్నేరియా ఆల్టర్నాటా | > 40 |
ఎ. టొమాటోఫిలా | > 40 |
హెల్మింతోస్పోరియం సోలని | > 40 |
ఫెల్లినస్ ఫెర్రుగినియోవెలుటినస్ | > 40 |
స్టెంఫిలియం వెసికారియం | > 40 |
ఇలియోనెక్ట్రియా క్రాస్సా | > 40 |
క్లాడోస్పోరియం క్లాడోస్పోరియోయిడ్స్ | > 40 |
సి. ఫుల్వమ్ | > 40 |
అక్రోడోంటియం లుజులే | > 40 |
పెన్సిలిన్ను sp. | > 40 |
గమనిక. * అన్ని నమూనాలలో DNA మొత్తం 10 ng.
కనిపించే లక్షణాలు లేకుండా నెక్రోట్రోఫిక్ వ్యాధికారక మరియు విత్తన బంగాళాదుంప దుంపల లక్షణాలతో టమోటా ఆకు నమూనాలలో C. కోకోడ్లను గుర్తించడానికి అభివృద్ధి చెందిన పరీక్షా విధానం ఉపయోగించబడింది. అధ్యయనం కోసం, మేము కోస్ట్రోమా, మాస్కో, కలుగా, నిజ్నీ నొవ్గోరోడ్ ప్రాంతాలలో పెరిగిన వివిధ రకాలైన విత్తన దుంపలను తీసుకున్నాము. C. cocodes DNA ఉనికిని నమూనాలలో ముఖ్యమైనదిగా పరిగణించారు, దీని విశ్లేషణలో థ్రెషోల్డ్ సైకిల్ 35 మించలేదు. ఈ థ్రెషోల్డ్ విలువ 0.05 ng C. cocodes DNA (థ్రెషోల్డ్ సైకిల్ 33.5,) యొక్క విశ్వసనీయ నిర్ణయం ఆధారంగా ఎంపిక చేయబడింది. టేబుల్ 2) మరియు థ్రెషోల్డ్ సైకిల్లు 40 కంటే ఎక్కువ, కొన్ని ఇతర జాతుల శిలీంధ్రాల యొక్క నిర్దిష్ట DNA లేనిది నిర్ధారణ చేయబడింది. ఈ విధానంతో, కోస్ట్రోమా, మాస్కో, కలుగా ప్రాంతాలలో పెరిగిన దుంపల యొక్క 5 నమూనాలలో మరియు క్రాస్నోడార్ ప్రాంతంలోని యెయిస్క్ ప్రాంతం (టేబుల్స్ 4, 5) నుండి ఒక టమోటా ఆకులో C. కోకోడ్స్ DNA యొక్క ముఖ్యమైన ఉనికిని కనుగొనబడింది.
టేబుల్ 4. బంగాళాదుంప దుంపలపై కొల్లెటోట్రిచమ్ కోకోడ్లను గుర్తించడం *
నమూనా సంఖ్య | బంగాళదుంప రకం | వృద్ధి ప్రదేశం | C. కోకోడ్ల గుర్తింపు | థ్రెషోల్డ్ సైకిల్ |
---|---|---|---|---|
1 | రెడ్ స్కార్లెట్ | కోస్ట్రోమా ప్రాంతం | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | సంటే | మాస్కో ప్రాంతం | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | జుకోవ్స్కీ ప్రారంభంలో | మాస్కో ప్రాంతం | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | మోలీ | కలుగ ప్రాంతం | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | ఫాంటసీ | కలుగ ప్రాంతం | - | |
15 | గాలా | నిజ్నీ నొవ్గోరోడ్ ప్రాంతం. | - | |
16 | - |
గమనిక. * అన్ని నమూనాలలో DNA మొత్తం 50 ng.
టేబుల్ 5. టమోటా ఆకులపై కొల్లెటోట్రిచమ్ కోకోడ్లను గుర్తించడం *
నమూనా సంఖ్య | వృద్ధి ప్రదేశం | C. కోకోడ్ల గుర్తింపు | థ్రెషోల్డ్ సైకిల్ |
---|---|---|---|
1 | క్రాస్నోడార్ భూభాగం, క్రిమియన్ జిల్లా | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | క్రాస్నోడార్ భూభాగం, యీస్క్ జిల్లా | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* అన్ని నమూనాలలో DNA మొత్తం 50 ng.
మేము సృష్టించిన పరీక్షా విధానం బ్రిటిష్ పరిశోధకులు (కల్లెన్ మరియు ఇతరులు, 2002) సున్నితత్వం మరియు నిర్దిష్టతలో అభివృద్ధి చేసిన దానికంటే తక్కువ కాదు మరియు మొక్కల నమూనాల విశ్లేషణకు తగినది. సీడ్ గడ్డ దినుసుల విశ్లేషణ కోసం దాని అప్లికేషన్ హాని యొక్క బాహ్య సంకేతాలు లేకుండా దుంపలలో C. కోకోడ్ DNA ను గుర్తించడం మరియు ఆకుల సంక్రమణను విజయవంతంగా విశ్లేషించడం సాధ్యం చేసింది.
ఈ రోజు వరకు, రష్యాలో C. కోకోడ్ల ముట్టడి కోసం బంగాళాదుంప దుంపల విశ్లేషణ నిర్వహించబడలేదు. మా మొదటి అధ్యయనం రష్యన్ ఫెడరేషన్ యొక్క వివిధ ప్రాంతాలలో పెరిగిన 16 పరీక్షించిన సీడ్ దుంపలలో 5 C. కోకోడ్లను కలిగి ఉన్నాయని చూపించింది. బంగాళాదుంప దుంపల నల్ల మచ్చ అనేది రష్యాలో ఒక సాధారణ బంగాళాదుంప వ్యాధి అని ఇది చూపిస్తుంది మరియు బంగాళాదుంప పంట యొక్క వాల్యూమ్ మరియు నాణ్యతను తగ్గించడంలో దాని పాత్ర తక్కువగా అంచనా వేయబడింది.
టొమాటో ఆకుల విశ్లేషణ క్రాస్నోడార్ టెరిటరీలోని యీస్క్ జిల్లా నుండి ఒక ఆకులో C. కోకోడ్స్ DNA యొక్క ముఖ్యమైన ఉనికిని వెల్లడించింది. అంతకుముందు, బ్రిటిష్ పరీక్షా విధానాన్ని (కల్లెన్ మరియు ఇతరులు, 2002) ఉపయోగించి దక్షిణ రష్యాలోని టమోటా క్షేత్రాలను పరిశీలించినప్పుడు, C. కోకోడ్లను కలిగి ఉన్న ఆకులు కనుగొనబడ్డాయి మరియు కొన్ని క్షేత్రాలలో C. కోకోడ్లు సోకిన ఆకుల అధిక నిష్పత్తి కనుగొనబడింది (బెలోవ్ మరియు అల్., 2018). మాస్కో ప్రాంతంలోని క్రాస్నోడార్ మరియు ప్రిమోర్స్కీ టెరిటరీలలో, మేము టమోటా పండ్లను కనుగొన్నాము, దాని నుండి మేము C. కోకోడ్ల యొక్క స్వచ్ఛమైన సంస్కృతులను వేరుచేయగలిగాము. రష్యాలో టమోటాపై C. కోకోడ్లు ప్రస్తుతం నమ్ముతున్న దానికంటే చాలా విస్తృతంగా వ్యాపించే అవకాశం ఉంది మరియు దాని హానికరం కూడా తక్కువగా అంచనా వేయబడుతుంది.
ఈ విధంగా, ఈ రోజు వరకు, బంగాళాదుంపలు మరియు టమోటాలపై C. కోకోడ్ల విస్తృత పంపిణీపై తగినంత సమాచారం సేకరించబడింది.
బంగాళాదుంప మరియు టమోటా వ్యాధుల అభివృద్ధిలో ఈ ఫంగస్ పాత్రను బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి, రష్యాలో దాని ప్రాబల్యాన్ని పర్యవేక్షించడం, నేల మరియు విత్తనాల ఇన్ఫెక్షన్ల పాత్రను అధ్యయనం చేయడం మరియు నిల్వ సమయంలో నష్టాలలో బ్లాక్ స్పాట్ పాత్రను అధ్యయనం చేయడం అవసరం. PCR డయాగ్నస్టిక్స్ యొక్క ఉపయోగం ఈ పనిని గణనీయంగా సులభతరం చేస్తుంది మరియు రెండు పరీక్షా వ్యవస్థల యొక్క ఏకకాల ఉపయోగం విశ్లేషణ యొక్క ఖచ్చితత్వాన్ని గణనీయంగా పెంచుతుంది.
ఈ పనికి రష్యన్ సైన్స్ ఫౌండేషన్ నం. 18-76-00009 నుండి మంజూరు చేయబడింది.
ఈ కథనం "మైకాలజీ అండ్ ఫైటోపాథాలజీ" జర్నల్లో ప్రచురించబడింది (వాల్యూమ్ 54, నం. 1, 2020).